Knowledge Center

SDS-PAGE

Sodium Dodecyl Sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) เป็นเทคนิคที่ใช้วิเคราะห์หาน้ำหนักโมเลกุลของพอลิเพปไทด์สายเดี่ยวและดูความบริสุทธิ์ของโปรตีน โดยอาศัยการเชื่อมต่อของ acrylamide monomer จนเป็นสายโซ่ยาวประกอบกันเป็นแผ่นเจล โดยมี TEMED เป็น catalyst และมี ammonium persulfate เป็น initiator

โปรตีนอยู่ในบัฟเฟอร์ที่เป็นด่างและประกอบด้วย sodium dodecyl sulfate (SDS) ซึ่งเป็น anionic detergent โดย SDS จะจับพอลิเพปไทด์ด้วยอัตราส่วน 1.4 กรัม SDS/กรัมโปรตีน โดยมี -mercaptoethanol หรือ dithiotreithol เป็น reducing agent เพื่อใช้ทำลายพันธะ disulfide โปรตีนที่จับกับ SDS จะมีประจุลบ เมื่อให้กระแสไฟฟ้า โมเลกุลที่มีประจุลบจะเคลื่อนที่เข้าหาขั้วบวก ซึ่งอัตราการเคลื่อนที่ของโปรตีนจะเร็วหรือช้าขึ้นกับขนาดน้ำหนักโมเลกุลและขนาดของรูพรุนของเจล (โมเลกุลขนาดใหญ่เคลื่อนที่ช้ากว่าโมเลกุลขนาดเล็ก) โดยขนาดของรูพรุนสามารถปรับได้ตามความเข้นข้นของ acrylamide ความเข้มข้นของอะคริลาไมด์เพิ่มขึ้น ขนาดของรูพรุนจะเล็กลง เมื่อสิ้นสุดการทดลองจึงนำผลที่ได้ไปวิเคราะห์ข้อมูล

สิ่งที่ต้องเตรียม
  • อุปกรณ์
  • สารเคมี
  • โปรตีนมาตรฐาน (protein marker)

อุปกรณ์

  • ชุดอุปกรณ์รันเจล (ในรูปเป็นชุดอุปกรณ์จากบริษัท Hoefer Pharmacia Biotech Inc., Model SE250)
  • Power supply
  • ไมโครไปเปต (Micropipette)
  • ขวดสำหรับเตรียมสารเคมี
  • บีกเกอร์ (beaker)
  • กล่องพลาสติกสำหรับย้อมเจล

ชุดอุปกรณ์รันเจล จากบริษัท Hoefer Pharmacia Biotech Inc., (Model SE250)

สารเคมี

  • Acrylamide
  • Ammonium persulfate
  • Tris base
  • Hydrochloric acid
  • Sodium dodecyl sulfate
  • TEMED (Tetramethylethylenediamine)
  • Glycine
  • DTT (Dithiothreitol)
  • Coomassie Blue R250
  • เอทิลแอลกอฮอล์ 70 %
  • Acetic acid

โปรตีนมาตรฐาน

โปรตีนมาตรฐาน (protein marker/protein ladder) คือการนำเอาโปรตีนบริสุทธิ์ที่ทราบน้ำหนักโมเลกุลที่แน่นอนมาผสมรวมกัน เพื่อใช้ในการบอกน้ำหนักโมเลกุลและติดตามการเคลื่อนที่ของโปรตีนที่สนใจ โดยตัวอย่างของโปรตีนมาตรฐานมีดังนี้

1. แอ็คคู่โปรตีน ดีเทคเทเบิล (AccuProtein Detectable) เป็นผลิตภัณฑ์ที่ใช้บอกน้ำหนักโมเลกุลของโปรตีนในช่วงน้ำหนักโมเลกุลตั้งแต่ 19.7 kDa ไปจนถึง 114.6 kDa โดยเกิดจากการผสมกันระหว่าง โปรตีนมาร์คเกอร์ที่ไม่ติดสี (unstained protein marker) กับโปรตีนมาร์คเกอร์ที่ติดสี (prestained protein marker) โดยแบนด์โปรตีนที่ติดสีนั้นมีอยู่แบนด์เดียวคือโปรตีนที่มีน้ำหนักโมเลกุลเท่ากับ 24.3 kDa ผลิตภัณฑ์ดังกล่าวจึงเหมาะสมสำหรับงานวิจัยที่ไม่ต้องติดตามการเคลื่อนที่ของแบนด์โปรตีนระหว่างการรัน ทั้งนี้หลังจากรัน SDS-PAGE เสร็จแล้ว หากนำเจลไปย้อมสี Coomassie หรือย้อม Silver ก็จะทำให้เห็นโปรตีนทุกตัวในผลิตภัณฑ์

2. แอ็คคู่โปรตีน พรีสเตน (AccuProtein Prestained) เป็นผลิตภัณฑ์โปรตีนมาร์คเกอร์ที่ใช้บอกน้ำหนักโมเลกุลของโปรตีนในช่วงน้ำหนักโมเลกุลตั้งแต่ 19.7 kDa ไปจนถึง 114.6 kDa ซึ่งโปรตีนทุกตัวในผลิตภัณฑ์นี้เป็นโปรตีนที่ย้อมติดสีมาแล้ว เหมาะสำหรับการศึกษาโปรตีนทุกชนิด ใช้ในการวิเคราะห์โปรตีนที่ต้องการติดตามการเคลื่อนที่ในระหว่างการทำ SDS-PAGE ขณะรัน SDS-PAGE สามารถเห็นสีย้อมที่ติดอยู่บนโปรตีนอย่างชัดเจน และสามารถนำไปใช้ต่อในการทดลอง Western Blot ได้อีกด้วย

ขั้นตอนการรัน SDS-PAGE

1. เตรียมชุดอุปกรณ์สำหรับทำ SDS – PAGE

สำหรับการทดสอบนี้ใช้ชุดอุปกรณ์จากบริษัท Hoefer Pharmacia Biotech Inc., (Model SE250) (User manual SE250) ประกอบด้วย

- Chamber
- Notched alumina plates
- Dual Gel Caster
- Spacer
- Gasket
- Glass plates
- Spring clamp
- Comb

2. กระจก

นำกระจก (glass plate) ขนาด 8x10 เซนติเมตร และ notched alumina plates มาเช็ดทำความสะอาด จากนั้นนำกระจกและ notched alumina plates มาประกบกันโดยมี spacer คั่นไว้ตรงกลาง จากนั้นนำมาประกอบเข้ากับ dual gel caster (ดังภาพ)

ภาพจาก http://www.gelifesciences.com/

Tips: ควรทดสอบการรั่วของกระจกทุกครั้งโดยการนำน้ำมาเติมให้เต็มช่องว่างระหว่างกระจกกับ notched alumina plates ทิ้งไว้ประมาณ 10 นาที ถ้ามีการรั่วไหลน้ำในกระจกจะลดระดับลงมา (ต้องทำการเตรียม gel sandwich ใหม่)

3. เตรียม Separating gel

โดย ผสมสารเคมีตามเปอร์เซ็นต์เจลที่ต้องการใช้

สารเคมี 12% gel 15% gel
30% acrylamide 2 ml 2.5 ml
1.5 M Tris-HCl pH 8.8 1.25 ml 1.25 ml
10% Ammonium persulfate 25 µl 25 µl
10% SDS 200 µl 200 µl
TEMED 5 µl 5 µl
Distilled water 1.75 ml 1.25 ml

Tips: การเตรียม separating gel ให้ใส่ TEMED ไว้ลำดับสุดท้ายก่อนที่จะเติมลงใน gel sandwich เพราะ TEMED จะเป็นตัว induce ทำให้เกิดการ polymelization เจลจะแข็งตัวอย่างรวดเร็ว และ ammonium persulfate (APS) ควรเตรียมใหม่ทุกครั้งเนื่องจาก APS เป็นตัวทำให้เกิด free radical ซึ่งมีผลต่อการเกิด polymerization

4. เติม Separating gel ลงใน gel sandwich

ค่อยๆเติมสารละลายที่ได้จากข้อ 3 ลงใน gel sandwich โดยใช้ pipette ค่อยๆ เติมสารละลายลงอย่างช้าๆ เพื่อลดโอกาสในการเกิดฟองอากาศ เมื่อเติมสารละลาย ได้ประมาณ ¾ ส่วนของกระจก ให้เททับ (overlay) ผิวหน้าเจลด้วยน้ำ (distilled water) หรือ butanol (water-saturated butanol) จากนั้นรอจนกระทั่งเจลแข็ง (polymerization) ประมาณ 30-45 นาที เมื่อเจลแข็งให้เทน้ำ หรือ butanol ออก ซับให้แห้ง

Tips 1: การเททับผิวหน้าด้วยน้ำ หรือ water-saturated butanol จะทำให้ผิวหน้าเจลเรียบ ไม่มีฟองอากาศ แต่การใช้ water-saturated butanol จะประสิทธิภาพดีกว่าการใช้น้ำ เนื่องจากน้ำสามารถไปละลาย acrylamide ทำให้สัดส่วนในสารละลายเปลี่ยนไป (acrylamide จะเจือจางลง) (http://www.ruf.rice.edu/)

Tips 2: การทดสอบว่าเจลแข็ง (polymerized) ให้สังเกตจากสารละลายในภาชนะที่ใช้ในการผสม ถ้าเจลในภาชนะแข็งใน gel sandwich ก็แข็งเช่นเดียวกัน หรือเอียง dual gel caster ถ้าเจลแข็งแล้วจะเห็นขอบเจลขณะที่เอียง (ดังภาพ)

5. เตรียม stacking gel

โดย ผสมสารเคมีตามสัดส่วนที่ต้องการ โดยใส่ TEMED เป็นลำดับสุดท้ายเช่นเดียวกัน

สารเคมี ปริมาณที่ใช้ (5% gel)
30% acrylamide 335 µl
0.5 M Tris-HCl pH 6.8 500 µl
10% Ammonium persulfate 15 µl
10% SDS 80 µl
TEMED 5 µl
Distilled water 1070 µl

6. โหลด stacking gel ลงใน gel sandwich

หลังจากเทน้ำหรือ butanol ออก พร้อมซับน้ำให้แห้ง จากนั้นนำ comb มาใส่ระหว่างช่องว่างของกระจกและ notched alumina plates จากนั้นค่อยๆ โหลด stacking gel ที่ผสมเรียบร้อยแล้วลงไปให้ท่วมกระจก รอจน Stacking gel แข็งตัว ประมาณ 20 นาที

Tips1: ตอนใส่ comb ควรจัดให้ comb อยู่ตรงกลาง ไม่เอียง เพื่อให้การทดสอบมีประสิทธิภาพ

Tips2: ขณะโหลด stacking gel ควรสังเกตฟองอากาศบริเวณ comb ต้องไล่ฟองอากาศออกให้หมด เพราะจะทำให้ผิวหน้าเจลไม่เรียบ

7. นำ gel sandwich ไปประกอบกับ chamber

เมื่อ stacking gel แข็งตัวให้ถอดออกจาก dual gel caster แล้วนำไปประกอบเข้ากับ gasket ใน chamber โดยหนีบด้วย spring clamp (ดังภาพ)

8. เตรียม gel sandwich สำหรับทดสอบโปรตีน

เมื่อประกบ gel sandwich กับ gasket เรียบร้อยแล้ว เท Running buffer ให้ท่วมเจล และเติมในถาด chamber จากนั้นค่อยๆ ดึง comb ออกจาก stacking gel (ดังภาพ)

Tips1: ขณะที่ดึง comb ออกจากเจลควรให้มี buffer ท่วมเจลอยู่เพื่อป้องกันเจลฉีกขาด หลังจากนั้นให้ใช้ micropipette ดูด buffer ขึ้นมาล้างเศษเจลที่ติดอยู่ในหลุม (well) มิฉะนั้นเศษเจลที่ติดอยู่จะทำให้ไม่สามารถโหลดโปรตีนได้ (ดังภาพ)

Tips2: ถ้ายังไม่ชำนาญก่อนที่จะดึง comb ให้ทำสัญลักษณ์โดยการใช้ปากกาขีดไว้ เพราะตอนที่ดึง comb ออกมาจะไม่สามารถมองเห็น well

9. เตรียมตัวอย่างโปรตีนทดสอบ

โปรตีนที่นำมาทดสอบควรนำไปคำนวนปริมาณโปรตีนก่อนทำการโหลดให้ได้ 20 mg/well (20mg ใน 20ul) โดยวิธี Bradford assay เพื่อให้ปริมาณโปรตีนไม่เยอะจนเกินไปจากนั้นนำโปรตีนมาเติม DTT และ loading dye แล้วนำไปต้มในน้ำเดือด 5 นาที ก่อนนำไปโหลดลงใน well (อย่าให้ตัวอย่างล้นออกมานอก well)

Tips1: กรณีที่ตัวอย่างที่ทดสอบมีเกิน 20 µl ให้โหลดไปก่อน 20 µl จากนั้นรันให้ตัวอย่างเคลื่อนไปใน stacking gel บางส่วน (อย่าทิ้งไว้จนโปรตีนเคลื่อนที่มาถึง separating gel) แล้วโหลดตัวอย่างที่เหลือเพิ่ม

Tips2: ในการรันโปรตีนที่สนใจควรทดสอบควบคู่กับโปรตีนมาตรฐาน (protein marker) เพื่อให้รู้น้ำหนักโมเลกุล (molecular weight) ของโปรตีนที่สนใจ และ protein marker ที่เลือกใช้ควรมีน้ำหนักโมเลกุลที่ครอบคลุมกับน้ำหนักโมเลกุลของโปรตีนที่สนใจ

10. การรันทดสอบโปรตีนที่สนใจ

หลังจากโหลดตัวอย่างโปรตีนเรียบร้อยแล้วให้ปิดฝา (safety lid) ให้แน่น จากนั้นต่อขั้วไฟฟ้าเข้ากับ power supply ให้ถูกต้อง ตั้งค่าความต่างศักย์ (voltage) และเวลา เริ่มทดสอบ (ดังภาพ)

Tips1: ความต่างศักย์ไฟฟ้า (voltage) ที่ใช้คือ 100 – 150 โวลต์ ในกรณีที่ใช้ความต่างศักย์สูงเกินไปจะทำให้ผลการทดลองที่ได้ไม่สวยงาม เพราะโปรตีนเคลื่อนที่เร็วอาจทำให้แถบโปรตีนโค้ง ถ้าโวลต์ที่ใช้ต่ำเกินไป จะทำให้เสียเวลาในการรอผลการทดลอง

Tips2: เวลาที่ใช้รันขึ้นกับ ความต่างศักย์ไฟฟ้า (voltage) และเปอร์เซ็นต์ของเจล สำหรับผู้ที่เริ่มทำ SDS-PAGE ให้คอยจับเวลาและสังเกตการเคลื่อนที่

11. ระหว่างการทดสอบ

ให้สังเกตการเคลื่อนที่ของสี (dye) หรือ การเคลื่อนที่ของ Protein marker เพื่อไม่ให้โปรตีนที่สนใจเคลื่อนที่จนหลุดออกจากเจล

Tips1: กรณีที่ใช้ unstained protein marker จะต้องสังเกตจากสีที่ผสมกับโปรตีน ระยะห่างระหว่างการเคลื่อนที่ของโปรตีนกับสีที่ผสมขึ้นกับเปอร์เซ็นต์เจลที่เตรียมขึ้นด้วย

Tips2: กรณีที่ใช้ prestained protein marker ให้ติดตามการเคลื่อนที่ของโปรตีนที่สนใจตามการเคลื่อนที่ของ protein marker ที่มีน้ำหนักโมเลกุลที่ใกล้เคียงกับโปรตีนที่สนใจ

12. การนำเจลออกจากกระจก

จับ spacer ที่กั้นระหว่างกระจกกับ notched alumina plates และใช้ spacer เป็นตัวดันกระจกออก ตัดส่วน stacking gel ออก จากนั้นนำเจลออกจาก Notched alumina plates ด้วย spacer เช่นกัน

Tips: ระหว่างที่นำเจลออกจากกระจกให้เปิดน้ำก๊อกเบาๆ ไหลผ่านตลอดเวลาเพื่อป้องกันเจลขาด

13. การย้อมสีโปรตีนที่ติดอยู่ในเจล

นำเจลที่ได้ใส่ลงในกล่องพลาสติก จากนั้นเทสีย้อมให้ท่วมเจลทิ้งไว้ข้ามคืน (overnight)

Tips: ขั้นตอนการย้อมสีโปรตีนสามารถทำการย้อมอย่างรวดเร็ว (rapid staining) โดยการเอากล่องใส่เจลไปแช่ในอ่างน้ำอุ่นประมาณ 1 ชั่วโมงและจึงค่อยล้างสีที่มากเกินพอออกไป (destaining)

14. นำเจลไปล้างสีย้อม (destaining)

เทสีย้อมที่มากเกินพอออก พร้อมกับล้างน้ำเพื่อให้สีส่วนเกินออก จากนั้นเท destaining solution ลงไปแช่ให้ท่วมเจล สามารถทำ rapid destaining ได้เช่นเดียวกัน ทำซ้ำ จนเห็นแบนด์โปรตีนติดสีขึ้นมา และพื้นหลัง ติดสีย้อมน้อยที่สุด


ก่อนย้อมด้วย Coomassie blue

หลังย้อมด้วย Coomassie blue

15. การอ่านผลการทดสอบ

จากรูปสามารถทราบน้ำหนักโมเลกุลของโปรตีนที่สนใจได้ 2 วิธี คือ
15.1 ดูจาก protein marker แล้วประมาณค่าของน้ำหนักโมเลกุล

เมื่อนำเอา protein marker และโปรตีนที่ต้องการทราบน้ำหนักโมเลกุลไปทดสอบด้วยวิธีการทำ Electrophoresis แบบ SDS-PAGE ดังรูป

เลน 2 พบว่าโปรตีนที่สนใจเคลื่อนที่ไปตรงกับตำแหน่งแบนที่ 5 ของ protein marker (นับจากล่างขึ้นบน) ทำให้ทราบว่าโปรตีนนั้นมีน้ำหนักโมเลกุลเท่ากับ protein marker ในตำแหน่งที่ 5 คือ 52 กิโลดาลตัน (kDa)

เลน 3 พบว่าโปรตีนที่สนใจเคลื่อนที่ไประหว่างแบนที่ 4 และ 5 ของ Protein marker (นับจากล่างขึ้นบน) แต่อยู่ใกล้กับ 40 kDa แสดงว่าโปรตีนที่สนใจน่าจะมีค่าประมาณ 42 kDa

15.2 นำ protein marker ไปทำ standard curve เพื่อให้ได้ค่าที่แม่นยำขึ้น
อาศัยการเปรียบเทียบระยะทางการเคลื่อนที่ของโปรตีนที่ทราบน้ำหนักโมเลกุลกับโปรตีนที่ต้องการศึกษา โดยการสร้างกราฟมาตรฐานความสัมพันธ์ระหว่างค่าลอการิทึมของน้ำหนักโมเลกุล (log MW) กับค่า relative migration distance (Rf) ) เพื่อคำนวณหาน้ำหนักโมเลกุลของโปรตีนจากสมการเส้นตรง y = mx + b ดังนั้นเมื่อทราบระยะทางการเคลื่อนที่ของโปรตีนที่ต้องการศึกษาจากการทำอิเล็กโตโฟเรซิส (Electrophoresis) แบบ SDS-PAGE ก็สามารถคำนวนหาน้ำหนักโมเลกุลได้ เมื่อนำมาเปรียบเทียบกับกราฟมาตรฐาน (ดังรูป)

16. อื่น ๆ

เปอร์เซ็นต์ acrylamide ที่เหมาะสมกับการรันโปรตีนในช่วงน้ำหนักโมเลกุลต่างๆ (Ninfa and Ballou, 2010)

เปอร์เซ็นต์ acrylamide ช่วงน้ำหนักโมเลกุล (ดาลตัน)
5-12 320,000-150,000
10-15 10,000-80,000
>15 <15,000